A sorologia trabalha com as respostas imunes dos animais que podem ser utilizadas para diagnóstico laboratorial:
1. Uso de anticorpos específicos para detectar antígenos
2. Detecção de anticorpos específicos no soro para determinar se o animal foi exposto ao antígeno
Sorologia = medição de interações antígeno-anticorpo
Técnicas de sorologia para diagnóstico
1. Testes de conjugação primários: medem diretamente a conjugação de um antpigeno com um anticorpo.
2. Testes de conjugação secundários: medem os resultados da interação antígeno-anticorpo in vitro – mais simples e menos sensíveis que os primários.
3. Testes de conjugação terciários: medem o efeito protetor real dos anticorpos no animal – mais complexos.
Reagente empregados nos testes de sorologia
• Soro: fonte mais comum de anticorpos. É obtido após coagulação sanguínea. Pode ser armazenado e congelado. Pode-se retirar o sistema complemento aquecendo o soro a 56°C por 30 minutos.
• Complemento: constituinte noraml do soro quando não aquecido.
• Antiglobulinas: as imunoglobulinas são proteínas complexas que funcionam como antígeno quando injetadas em animal de espécie diferente. Os receptores respondem produzindo anticorpos específicos que são as antiglobulinas.
• Anticorpos monoclonais:derivados de hibridomas puros e específicos podem ser usados como reagentes químicos-padrão.
TESTES IMUNOENZIMÁTICOS
Elisa
Indireto: anticorpos
1. Reveste-se os poços nas placas de poliestireno com uma solução de antígeno;
2. Lavar: remoção do antígeno não conjugado – tubos permanecem revestidos com uma camada de antígeno;
3. O soro a ser testado é acrescentado ao tubo – anticorpos se conjugam com antígeno na parede do tubo;
4. Incubar e lavar os tubos – remoção de anticorpos não-conjugados;
5. Detecção de presença de anticorpos conjugados através da adição de uma antiglobulina ligada a uma enzima – conjugado se conjuga com o anticorpo;
6. Incubação e lavanem – detecção e medição através da adição do substrato enzimático.
Parvovirose: etiologia, diagnóstico, tratamento
Enzima e substrato são escolhidos a fim de que produto colorido se desenvolva. A intensidade da cor é proporcional à quantidade de antiglobulina que é, por sua vez, proporcional à quantidade de anticorpo presente no soro sob teste. A intensidade pode ser avalida a olho nu ou usando-se espectrofotômetro.
Direto: Antígeno
1. Revestimento de tubos de poliestireno com anticorpos específicos de captura;
2. Acrescenta-se solução de antígenos;
3. Lavagem para retirar o que não foi conjugado;
4. Acrescenta-se um anticorpo específico, antiglobulina marcada com enzima e um substrato (idem indireta);
A intensidade da cor é diretamente proporcional com a quantidade de antígeno conjugado.
Elisa com antígeno marcado: usado nos kits diagnósticos manufaturados. Técnica que funciona bem para teste de sangue completo, pois não há necessidade de lavagem na imunoglobulina conjugada.
1. O antígeno se conjuga com a placa antes do teste;
2. Acrescenta-se o anticorpo a ser testado;
3. Lavagem;
4. Conjugação do anticorpo com o antígeno.
Coronavirose: etiologia, tratamento, patologia
Nas infecções virais, os ELISAs são realizados em micropoços que utilizam placas de poliestireno ou como teste de filtro de membrana. O filtro pode ser revestido com anticorpos e ser utilizado para detectar antígenos.
Uma vantagem dos filtros de membrana é que o anticorpo pode conjugar com uma parte do filtro, enquanto que os controles positivo e negativo podem ser colocados em outros pontos do mesmo filtro.
Pode-se utilizar ELISA para testar fluidos com sangue, saliva, lágrima, etc.
Técnicas de Imunoperoxidase
As enzimas conjugadas com imunoglobulinas ou antiglobulinas podem ser utilizadas para identificar antígenos específicos em cortes teciduais. O marcador mais utilizado é o peroxidase rabanete picante.
Direto:
1. Corte tecidual com um anticorpo marcado com enzima;
2. Após ser lavado, incuba-se o tecido em um substrato enzimático;
3. O antígeno conjugado pe detectado pela presença de um depósito castanho no sítio de conjugação com o anticorpo.
Indireto: o anticorpo conjugado é detectado através de uma antiglobulina marcada.
Western Blotting
Teste de conjugação primária em 3 estágios:
Estágio 1: envolve uma eletroforese de uma mistura de antígenos em géis, de forma que se defina cada componente em uma única faixa.
Estágio 2: envolve a formação de um “blotting” ou a transferência dessas proteínas para um papel imobilizador, colocando-se uma membrana de nitrocelulose em cima do gel a ser transferido e fazendo-se um sanduíche com os dois entre gazes saturadas com tampão. O sanduíche é sustentado em folhas de plástico rígido colocadas em um reservatório tampão e passa-se uma corrente elétrica entre as gazes. As faixas de proteína são transferidas do gel para a membrana de nitrocelulose sem perda da resolução.
Estágio 3: envolve a visualização dos antígenos transferidos por meio de um imunoensaio enzimático ou radioimunoensaio. Quando utiliza-se o imunoensaio enzimático incuba-se primeiro a membrana em um anti-soro específico. Lava-se a membrana e acrescenta-se solução de antiglobulina marcada com enzima. Lava-se e acrescenta-se substrato, o que desenvolve uma cor nas faixas onde o anticorpo se conjuga com o antígeno.
Quando se utiliza marcador isótopo, é necessário auto-radiografia para identificar a faixa marcada por meio do escurecimento da emulsão radiográfica.
Decalque de ponto: Passa-se uma solução de antígeno através de um filtro de nitrocelulose, de forma que qualquer proteína se conjugue com a membrana.
A presença do antígeno é detectada utilizando-se um anti-soro específico e uma antiglobulina marcada com uma enzima. Após exposição da membrana ao substrato enzimático,a presença de um ponto corado constitui uma reação positiva.
TESTES DE CONJUGAÇÃO SECUNDÁRIA
A reação entre um antígeno e um anticorpo é seguida por uma reação. Se os anticorpos se conjugarem com antígenos solúveis em solução, os complexos resultantes podem se precipitar. Se os antígenos foram particulados (ex: bactérias, hemácias), os anticorpos farão com que eles se aglutinem. Se o anticorpo puder ativar o complemento clássico e o antígeno se encontrar em uma superfície celular, ocorre lise da célula.
TITULAÇÃO DE ANTICORPOS
Usado para medir níveis de anticorpos específicos. Realiza-se a titulação, diluindo-se o soro sob teste em uma série de concentrações decrescentes. A diluição é testada quanto à atividade. O recíproco da diluição mais alta que dá uma reação positiva chama-se título e proporciona uma estimativa da quantidade de anticorpo em casa soro.
Aglutinação
Anticorpo são bivalentes por isso podem se ligar cruzadamente com um antígeno. Os anticorpos diferem na sua capacidade de produzir aglutinação (IgM aglutinam mais do que IgG, por exemplo).
Não há aglutinação quando existe uma quantidade muito grande de anticorpos para uma quantidade pequena de antígenos e quando há anticorpos não específicos para o antígeno em questão.
Teste de Antiglobulinas
Se for necessário testar quanto à presença de anticorpos não aglutinantes na superfície da partícula, tais com bactérias ou hemácias, então pode-se utilizar um teste de antiglobulina direto.
Misturam-se as partículas lavadas com uma antiglobulina e, se as imunoglobulinas se encontrarem presentes em sua superfície, ocorrerá aglutinação.
Cinomose: etiologia, epidemiologia, patogênese
Hemoaglutinação viral e sua inibição
Alguns vírus são capazes de se conjugar e aglutinar hemácias de mamíferos e avarias. Isso pode ajudar a caracterizar um vírus desconhecido.
A inibição da hemoaglutinação viral por meio de um anticorpo pode ser utilizada tanto como um método de identificação de um vírus específico como para medir níveis de anticorpos no soro.
Teste de fixação do complemento (TFC)
A ativação do sistema complemento clássico por anticorpos conjugados a antígenos resulta na geração de um complexo de ataque à membrana (CAM) que destroem a membrana celular. Isso pode ser utilizado para medir os níveis de anticorpos em teste.
1. Incuba-se o antígeno e o soro sob teste (após aquecido a 56°C para destruir seu complemento) na presença de soro normal de cobaia (fonte do complemento).
2. Após a reação antígeno-anticorpo-complemento, a quantidade de complemento livre é medida através da adição de um sistema indicador que consiste de hemácias ovinas recobertas com anticorpos.
3. A lise dessas hemácias (solução vermelha transparente) é um resultado negativo, pois indica que o complemento não foi ativado e que o anticorpo estava ausente no soro sob teste. Já a ausência de lise (suspensão de hemácias turva) é um resultado.
É comum realizar a titulação do soro a ser testado, à medida que é diluído, a reação em cada tubo mudará de nenhuma lise (positiva) à lise (negativa), se os anticorpos estiverem presentes.
ENSAIOS EM SISTEMAS VIVOS
Se um microrganismo ou antígeno possuir uma atividade biológica, pode-se ensaiar os anticorpos através de sua capacidade de neutralizar essa atividade, que pode incluir hemólise de hemácias, lise de células nucleadas, doença ou morte dos animais.
Testes de Neutralização
Estimam a capacidade de o anticorpo neutralizar a atividade biológica do antígeno quando misturados in vitro. Podem ser também usados para identificar toxinas bacterianas.
Pode-se impedir os vírus de infectar as células após um anticorpo específico ter se combinado com ele e bloqueado seus locais de conjugação.
Essa reação é base dos testes de neutralização empregados tanto para identificação de vírus desconhecidos como para a medição de anticorpos virais específicos e sensíveis.
APLICAÇÕES DIAGNÓSTICAS DOS TESTES IMUNOLÓGICOS
A presença de anticorpos contra um microrganismo específico em um soro indica uma exposição anterior a um epítopo presente nesse agente. Porém, não fornece provas de que a infecção exista ou que alguma doença intercorrente seja causada por esse microrganismo.
Uma resposta imune a um microrganismo invasor gera um anti-soro específico, que contém uma coleção heterogênea de anticorpos A especificidade do anti-soro refletirá a especificidade dominante da população de anticorpos. Por isso, a presença de anticorpos contra um microrganismo em uma amostra sérica única raramente possui uma importância diagnóstica. Para tanto, faz-se necessária a cólera de pelo menos três amostras em 1 a 3 semanas de intervalo e mostrar uma elevação de quatro vezes no título juntamente com análise de quadro clínico.
Há também a possibilidade de erros técnicos, que podem ser evitados através da incorporação de controles apropriados no sistema de teste. Pode ocorrer também falsos positivos e falsos negativos.
Um teste no qual a grande proporção dos resultados positivos é falsa é considerado inespecífico, enquanto que um com uma alta proporção de resultados falsos-negativos é considerado insensível.
PRECIPITAÇÃO
A mistura de uma solução de antígenos solúveis com um anti-soro forte, fica turva dentro de alguns minutos, depois floculenta e após algumas horas, um precipitado se sedimenta no fundo do tubo.
O precipitado consiste em complexos antígeno-anticorpo. Não se forma nenhum precipitado óbvio em concentrações antigênicas baixas. À medida que a quantidade de antígeno aumenta, formam-se quantidades maiores de precipitado até que seja máxima.
Com a adição de mais antígeno, a quantidade de precipitado diminui gradualmente até que não se observe mais nenhum precipitado nos tubos que contenham um grande excesso de antígeno.
Esses resultados podem ser explicados porque em gral os anticorpos são bivalentes, podendo se ligar cruzadamente com somente dois epítopos, porém antígenos complexos são multivalentes, possuindo muitos epítopos.
Quando ocorre excesso de anticorpos, cada molécula de antígeno é recoberta com anticorpos, evitando ligação cruzada e consequentemente a precipitação. Quando os reagentes se encontram em proporções ideais, a proporção de antígenos com relação a anticorpos é tal que a ligação cruzada e formação de treliças tornam-se extensas.
À medida que essa treliça cresce, ela se torna insolúvel e se precipita. Nas misturas com excesso de antígeno, cada molécula de anticorpo se conjuga com duas moléculas de antígeno. A ligação cruzada adicional se torna impossível e como esses complexos são pequenos e solúveis não ocorre precipitação.
Imunodifusão ou difusão em gel
Método simples de precipitação de antígenos por parte dos anticorpos.
1. Cortam-se dois poços redondos com 5mm de diâmetro e 1 cm de espaçamento em uma camada de ágar;
2. Preenche-se um poço com antígeno solúvel e o outro com anti-soro, os reagentes se difundirão para fora radialmente;
3. Quando os reagentes se encontrarem em proporções ideais, surgirá uma linha de precipitado branca e opaca;
4. Se as soluções utilizadas contiverem vários antígenos e anticorpos diferentes, é improvável que cada componente alcance as proporções ideais exatamente na mesma posição, assim, produz-se uma linha de precipitado separada para cada grupo de antígenos e anticorpos interagentes;
Pode-se utilizar esse teste para determinar a relação entre os antígenos. Caso se crie dois poços de antígeno e um poço de anticorpo, se formarão linhas entre cada poço de antígeno e anticorpo.
• Se essas duas linhas se juntarem, os dois antígenos são provavelmente idênticos.
• Se as linhas se cruzarem, os dois antígenos são completamente diferentes.
• Se as linhas se fundirem com a formação de uma espora, existe uma identidade parcial, indicando que um antígeno possui epítopos ausentes no outro.
Fonte: TIZARD, Ian R. Imunologia Veterinária: uma introdução. 5 ed. São Paulo: Roca, 1998.
Materiais para estudo: